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本试剂盒采用Poly(A)加尾法原理，首先miRNA 3’末端加Poly(A)尾，再使用Anchored oligo(dT)-universal tag通用逆转录引物进行逆转录反应，最终生成miRNA对应的cDNA第一链。本试剂盒采用特殊优化预混合miRNA RT Enzyme Mix将Poly(A)加尾和反转录合并为一步完成，简化了操作步骤并提高Poly(A)加尾和逆转录效率，该试剂盒具有可从20pg-2μμg的Total RNA中有效制备miRNA对应的cDNA第一链。一次合成的cDNA可检测多个microRNA，节约了样品和成本。

组分	规格
miRNA RT Enzyme Mix	50μL
2×miRT Reaction Mix	250μL
RNase-free H2O	1mL

保存：-20℃


一、miRNA 3’末端进行Poly (A)加尾和逆转录反应（第一链合成）

• 解冻2×miRNA RT Reaction Mix并混匀，miRNA RT Enzyme Mix放于冰中备用，加入以下试剂至总体积20μL(miRNA RT Enzyme Mix最后加入)。
  

  成分	用量	终浓度
  Total RNA	xμL	至2μg
  2×miRNA RT Reaction Mix	10μL	1×
  miRNA RT Enzyme Mix	2μL	-
  RNase-free H2O	至20μL	-

  
  注意：
  ① miRNA RT Enzyme Mix非常粘稠，溶液容易吸附在管壁和吸头外导致损失，用前请点甩离心，并且避免吸头外壁沾附损失。Enzyme Mix内酶都是过量的，即使每次按照1.8μL使用，也不影响使用效果。
  ② 在反应中使用的total RNA必须包含有小分子RNA (miRNA)。此过程也可以使用富集的mi RNA单纯miRNA无法直接用分光光度计定量，建议直接加入2μL～5μL。可根据目的miRNA丰度决定加入量，但是对于低丰度miRNA样品而言如血清血浆提取物))，可直接加入最大体积8μL。
  
• 移液器轻轻混匀上述配制的反应液，短暂离心后在42℃反应60min。
  
• 85℃加热5秒钟失活miRNA RT Enzyme Mix。
  
• 合成的cDNA反应液可放置于-20℃保存，也可以直接进行下游PCR或者荧光定量PCR检测。
  注：按照上述操作步骤得到的cDNA模板用于下游PCR或者荧光定量PCR检测时，可以根据实际情况选择使用量，对于特殊的检测体系中，高含量的cDNA模板易导致非特异性扩增，可根据所检测miRNA的丰度适当的稀释cDNA（5～10倍或者100倍）后使用。如果发现有非特异扩增条带，或者融链曲线显示有非特异扩增，往往提示cDNA模板过量，可以尝试将上述cDNA模板稀释几十到几百倍甚至上千倍再使用。

二、选购并按照我公司的miRNA Real-Time PCR Assay kit(货号：ALH190)进行定量PCR。
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